Methoden & Technologien

Als weiterführende Methode zum Nachweis chromosomaler Imbalancen (copy number variants, CNV’s) hat in den letzten Jahren die Array-CGH (komparative genomische Hybridisierung) oder molekulare Karyotypisierung in die Diagnostik Einzug gehalten. Hierbei handelt es sich um ein Verfahren, das ähnlich wie die FISH-Diagnostik auf einer Hybridisierung basiert. Die Array-CGH erfasst aber – wie die Chromosomenanalyse – das gesamte Genom, jedoch mit einer wesentlich höheren Auflösung, die in der Routinediagnostik mittlerweile unter 100 kb liegt. Das Prinzip der Array-CGH basiert auf dem Einsatz von kurzen Oligonukleotiden (40 – 60 bp), welche auf einer Matrix immobilisiert vorliegen. Diese decken repräsentativ das gesamte Genom ab, wobei die mittlere Auflösung vom Array-Typ und der Gesamtzahl an Oligonukleotiden abhängt. Die Oligonukleotide tragen zum Genom komplementäre Sequenzen, an welche eine Patienten-DNA und eine Referenz-DNA kompetitiv hybridisieren können. Durch diese vergleichende Hybridisierung können sehr kleine, submikroskopische Veränderungen (Deletionen, Duplikationen) beim Patienten nachgewiesen und durch den Einsatz spezieller Softwareprogramme die an den Veränderungen beteiligten Gene identifiziert werden.

Balancierte Translokationen, Inversionen und Insertionen sowie geringgradige Mosaike können mit der Array-CGH allerdings nicht detektiert werden. Die Array-CGH kann die klassische Zytogenetik und Tumorzytogenetik daher nicht ersetzen, aber sinnvoll ergänzen.

CGH+SNP-Array-Technik

Durch den Einsatz polymorpher Oligonukleotide („SNP-Marker“) in Kombination mit den nicht-polymorphen Oligonukleotiden der Array-CGH-Technik wird neben dem Nachweis von Deletionen und Duplikationen auch die Detektion von Kopienzahl-neutralen Veränderungen, sog. Loss-of-Heterozygosity (LOH)/uniparentale Disomien (UPD) ermöglicht. Bei den Kopienzahl-neutralen Veränderungen können ganze Chromosomen oder auch nur Teilstücke verloren gehen und die noch vorhandene Kopie wird zum Ausgleich des Verlusts als Vorlage genutzt und dupliziert. Dies kann dazu führen, dass defekte Allele verdoppelt werden und diese trotz des Vorhandenseins der genetischen Information nicht genutzt werden können, da sie ihre Funktionsfähigkeit verloren haben. Ein weiterer Vorteil dieser kombinierten Technik besteht in der höheren Sensitivität beim Nachweis von Mosaiken.

In der postnatalen Routinediagnostik werden 180k Oligo-Arrays der Firma OGT (Cambridge) mit einem durchschnittlichen Sondenabstand zwischen 22 und 54 kb verwendet. Bei dieser Methode werden eine Patienten- und eine Referenz-DNA mit 2 unterschiedlichen Farbstoffen markiert und auf dem Array hybridisiert. Beide markierte DNAs werden dann vergleichend genomisch hybridisiert und mittels Laser-Scanner wird das Verhältnis der Fluoreszenzsignale der Patienten- und Referenz-DNA ausgelesen. Eine Software-basierte Auswertung ermöglicht den Nachweis von Deletionen oder Duplikationen in der Patienten-DNA im Vergleich zur normalen Referenz-DNA. Durch den Einbau eines Restriktionsverdaus der beiden genomischen DNA-Proben vor der Hybridisierung ermöglicht diese Methode auch den auf der Auswertung von SNP’s basierten Nachweis Kopien-neutraler Veränderungen wie den Verlust der Heterozygotie (LOH), uniparentale Disomien (UPD) oder partielle Homozygotiebereiche mit einer Mindestgröße von 7 Mb

Laut Kapitel 11.4 des EBM (Ziffer 11500) erfordert eine Mikroarray-Analyse eine vorangegangene Chromosomenanalyse.

Postnatale Diagnostik

Die Anwendung der Mikroarray-Technik (insbesondere bei Kindern mit Entwicklungsverzögerung / Intelligenzminderung oder komplexen Retardierungs- und Fehlbildungssyndromen) hat zahlreiche neue Mikrodeletions- und -duplikationssyndrome definiert, die vor einigen Jahren noch völlig unbekannt waren. Durch den Einsatz der Array-CGH in der Routinediagnostik können nun vermehrt submikroskopisch kleine Imbalancen gefunden werden, die als ursächlich für die Mentale Retardierung (MR)/Entwicklungsverzögerung und ggf. weitere Symptome angesehen werden müssen. Auch Störungen aus dem autistischen Formenkreis, die nicht selten eine MR zeigen, gehen gehäuft mit bestimmten Kopienzahlveränderungen (copy number variants, CNV’s) einher, so dass auch diese Erkrankungen eine Indikation zur molekularen Karyotypisierung darstellen.