Zentrum für Humangenetik und Laboratoriumsmedizin, Dr. Klein, Dr. Rost und Kollegen

Molekulare Karyotypisierung (Chromosomale Microarray-Analysen, CMA)

Array-CGH-Technik

Als weiterführende Methode zum Nachweis chromosomaler Imbalancen (copy number variants, CNV’s) hat in den letzten Jahren die Array-CGH (komparative genomische Hybridisierung) oder molekulare Karyotypisierung in die Diagnostik Einzug gehalten. Hierbei handelt es sich um ein Verfahren, das ähnlich wie die FISH-Diagnostik auf einer Hybridisierung basiert. Die Array-CGH erfasst aber - wie die Chromosomenanalyse - das gesamte Genom, jedoch mit einer wesentlich höheren Auflösung, die in der Routinediagnostik mittlerweile unter 100 kb liegt. Das Prinzip der Array-CGH basiert auf dem Einsatz von kurzen Oligonukleotiden (40 – 60 bp), welche auf einer Matrix immobilisiert vorliegen. Diese decken repräsentativ das gesamte Genom ab, wobei die mittlere Auflösung vom Array-Typ und der Gesamtzahl an Oligonukleotiden abhängt. Die Oligonukleotide tragen zum Genom komplementäre Sequenzen, an welche eine Patienten-DNA und eine Referenz-DNA kompetitiv hybridisieren können. Durch diese vergleichende Hybridisierung können sehr kleine, submikroskopische Veränderungen (Deletionen, Duplikationen) beim Patienten nachgewiesen und durch den Einsatz spezieller Softwareprogramme die an den Veränderungen beteiligten Gene identifiziert werden.

Balancierte Translokationen, Inversionen und Insertionen sowie geringgradige Mosaike können mit der Array-CGH allerdings nicht detektiert werden. Die Array-CGH kann die klassische Zytogenetik und Tumorzytogenetik daher nicht ersetzen, aber sinnvoll ergänzen.

CGH+SNP-Array-Technik

Durch den Einsatz polymorpher Oligonukleotide („SNP-Marker“) in Kombination mit den nicht-polymorphen Oligonukleotiden der Array-CGH-Technik wird neben dem Nachweis von Deletionen und Duplikationen auch die Detektion von Kopienzahl-neutralen Veränderungen, sog. Loss-of-Heterozygosity (LOH)/uniparentale Disomien (UPD) ermöglicht. Bei den Kopienzahl-neutralen Veränderungen  können ganze Chromosomen oder auch nur Teilstücke verloren gehen und die noch vorhandene Kopie wird zum Ausgleich des Verlusts als Vorlage genutzt und dupliziert. Dies kann dazu führen, dass defekte Allele verdoppelt werden und diese trotz des Vorhandenseins der genetischen Information nicht genutzt werden können, da sie ihre Funktionsfähigkeit verloren haben. Ein weiterer Vorteil dieser kombinierten Technik besteht in der höheren Sensitivität beim Nachweis von Mosaiken

In der postnatalen Routinediagnostik werden 180k Oligo-Arrays der Firma OGT (Cambridge) mit einem durchschnittlichen Sondenabstand zwischen 22 und 54 kb verwendet. Bei dieser Methode werden eine Patienten- und eine Referenz-DNA mit 2 unterschiedlichen Farbstoffen markiert und auf dem Array hybridisiert.  Beide markierte DNAs werden dann vergleichend genomisch hybridisiert und mittels Laser-Scanner wird das Verhältnis der Fluoreszenzsignale der Patienten- und Referenz-DNA ausgelesen. Eine Software-basierte Auswertung ermöglicht den Nachweis von Deletionen oder Duplikationen in der Patienten-DNA im Vergleich zur normalen Referenz-DNA. Durch den Einbau eines Restriktionsverdaus der beiden genomischen DNA-Proben vor der Hybridisierung ermöglicht diese Methode auch den auf der Auswertung von SNP’s basierten Nachweis Kopien-neutraler Veränderungen wie den Verlust der Heterozygotie (LOH), uniparentale Disomien (UPD) oder partielle Homozygotiebereiche mit einer Mindestgröße von 7 Mb

Laut Kapitel 11.4 des EBM (Ziffer 11500) erfordert eine Mikroarray-Analyse eine vorangegangene Chromosomenanalyse.

Prinzip der Array-CGH: eine 1:1-Mischung aus Patienten- und Referenz-DNA, die zuvor mit 2 unterschiedlichen Farbstoffen markiert wurden, wird auf einer Matrix mit immobilisierten DNA-Sonden hybridisiert. Ein Laser-Scanner detektiert die sich ergebenden Fluoreszenzsignale und die Software-basierte Auswertung ermöglicht den Nachweis von Deletionen oder Duplikationen in der Patienten-DNA im Vergleich zur normalen Referenz-DNA.


Zytogenetik

Postnatale Diagnostik

Die Anwendung der Mikroarray-Technik - insbesondere bei Kindern mit Entwicklungsver-zögerung/Intelligenzminderung oder komplexen Retardierungs- und Fehlbildungs-syndromen - hat zahlreiche neue Mikrodeletions- und –duplikationssyndrome definiert, die vor einigen Jahren noch völlig unbekannt waren. Durch den Einsatz der  Array-CGH in der Routinediagnostik können nun vermehrt submikroskopisch kleine Imbalancen gefunden werden, die als ursächlich für die Mentale Retardierung (MR)/Entwicklungsverzögerung und ggf. weitere Symptome angesehen werden müssen. Auch Störungen aus dem autistischen Formenkreis, die nicht selten eine MR zeigen, gehen gehäuft mit bestimmten Kopienzahlveränderungen (copy number variants, CNV’s) einher, so dass auch diese Erkrankungen eine Indikation zur molekularen Karyotypisierung darstellen.

Nachweis einer 1,6 Mb großen Mikrodeletion 15q13 (roter Pfeil) bei einer Patientin mit Autismus und Intelligenzminderung; im Falle der Amplifikation 15q11.2 (grüner Pfeil) handelt es sich um eine benigne Variante.


Pränatale Diagnostik

Die Mikroarray-Analyse kann in der Pränataldiagnostik als sinnvolle Ergänzung zur zytogenetischen Routinediagnostik bei einem auffälligen fetalen Ultraschall und normaler Chromosomenanalyse sowie zur Charakterisierung einer neu entstandenen chromosomalen Strukturaberration beim Feten hinzugezogen werden. Laut EBM ist die pränatale Mikroarray-Analyse allerdings keine Kassenleistung.

Molekulare Onkologie

Mit Hilfe eines Arrays, der vor allem diejenigen Genregionen hochauflösend darstellt, die bei hämatologischen Neoplasien häufig Veränderungen aufweisen, können Deletionen und Amplifikationen einzelner Abschnitte des Erbguts in Blut- bzw. Knochenmarkproben identifiziert werden. Durch den gesamtgenomischen Ansatz werden auch solche Veränderungen nachgewiesen, die mit dem üblicherweise eingesetzten FISH-Panel nicht detektierbar sind. Weiterhin können komplexere Chromosomenveränderungen charakterisiert werden und durch den Einsatz hochauflösender Arrays Bruchpunktregionen, die in einer Chromosomenanalyse nachgewiesen wurden, genauer bestimmt werden. Mit Hilfe der SNP-Arrays können auch LOH-(loss of heterozygosity) bzw. UPD-(uniparentale Disomie)-Regionen detektiert werden. Zellkulturprobleme oder Kulturartefakte werden somit umgangen.

Literatur

Qiao et al. 2012, Clin Genet 83:145 / Hanemaaijer et al., Eur J Hum Genet 20:161 / Shaffer et al. 2012, Prenat Diagn 32:976 / Cooper et al. 2011, Nature Genet 43:838 / Shaffer et al. 2012, Prenat Diagn 32:344 / Hochstenbach et al. 2009, Eur J Med Genet 52:161 / Handyside et al. 2012, Eur J Hum Genet 20:742 / Geraedts et al. 2011, Human Reproduction 26:3173 / Magli et al. 2011, Human Reproduction 26:3181