Southern-Blot-Analyse

Komplexe Fragestellungen wie die Bestimmung der Anzahl von Gen-Kopien, der Länge von Trinukleotid-Expansionen oder die Untersuchung des DNA-Methylierungsstatus können mit Hilfe der Southern-Blot-Analyse geklärt werden. Im Gegensatz zur DNA-Sequenzierung ist bei der Southern-Blot-Analyse kein Amplifikationsschritt nötig. Der Nachweis erfolgt direkt an genomischer DNA, die zuvor einem Restriktionsverdau unterzogen wurde. Die Wahl der Restriktionsenzyme orientiert sich an der Fragestellung, welche DNA-Sequenzen untersucht werden sollen. Dem Restriktionsverdau schließt sich die Auftrennung der verdauten Fragmente auf einem Agarosegel an, die im zweiten Schritt mittels dem eigentlichen Southern-Blot-Verfahren auf eine Nylonmembran übertragen werden. Beim Kapillar-Blot nützt man einen Flüssigkeitsstrom (Kapillareffekt), der ausgehend von einem Reservoir an Pufferlösung über das Gel und die Membran bis hin zu einem Stapel von Papiertüchern läuft. Die DNA wird dabei mitgezogen und bleibt auf der Oberfläche der Nylonmembran hängen. Vor der Hybridisierung mit der markierten Sonde wird die DNA mittels Hitze oder UV-Behandlung auf der Membran fixiert. Neben den klassischen radioaktiven Verfahren werden Sonden zunehmend nichtradioaktiv markiert, wobei die Detektion indirekt über einen fluoreszenzmarkierten Antikörper erfolgt. Nach der Hybridisierung und mehreren Inkubations- und Waschschritten erfolgt die Detektion durch Auflegen eines Röntgenfilmes auf die Nylonmembran. Nach der Entwicklung kann das Bandenmuster anhand des geschwärzten Filmes ausgewertet werden.