Methoden & Technologien

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine Methode zur schnellen Vervielfältigung bestimmter DNA-Abschnitte. 

Für die PCR wird ein sequenzspezifisches, komplementäres Oligonukleotidpaar (Sense und Antisense Primer), thermostabile DNA-Polymerase und ein Mix der 4 Nukleotide Guanin (G), Adenin (A), Thymin (T) und Cytosin (C) benötigt. Die Primer haben eine Länge von 16-24 Basenpaaren und werden so ausgewählt, dass die Zielsequenz zwischen ihnen liegt. Die Auswahl der Primer ist ebenfalls ein kritischer Schritt, da neben der Amplifikation von unspezifischen Produkten vor allem die Amplifikation von Pseudogenen vermieden werden muss. Pseudogene sind inaktivierte Gene, deren Sequenz den zu untersuchenden Genen sehr ähnlich ist, wodurch falsche Ergebnisse entstehen können. Daher wird beim Primerndesign sowohl darauf geachtet, dass die Primersequenz  spezifisch für das die Sequenz des gewünschten PCR-Produkt ist und zudem nicht an Stellen mit häufigen Polymorphismen liegen, die die Bindung an das DNA-Template verhindern würden (Gefahr von Allelverlust). Die PCR wird in einem speziellen Gerät durchgeführt (Thermocycler), welches in der Lage ist, die Temperatur des Reaktionsblocks sehr rasch zu ändern. Verschiedene Temperaturen sind notwendig, um die DNA zunächst zu denaturieren (Bildung von Einzelsträngen bei 95°C), dann die Anlagerung der Primer zu ermöglichen (sog. Annealing bei 50-65°C) und schließlich die Elongation der Primer entlang der DNA-Matrize zu einem neuen Tochterstrang zu gewährleisten (Temperatur-Optimum der DNA-Polymerase bei 72°C). Dieser Vorgang (Denaturierung, Annealing, Strangelongation) wird auch PCR-Zyklus genannt und 30–40-mal wiederholt. Bei jedem Zyklus verdoppelt sich idealerweise der zwischen den Primern liegende DNA-Abschnitt, die Gesamtreaktion dauert etwa 1–2 Stunden. 

PCR-Produkte können unterschiedlich genutzt werden. Zumeist werden sie in Analyseverfahren wie Sequenzierung, MLPA, RealTime-PCR, RFLP, Fragmentlängenanalyse etc. weiterverwendet. 

Sie sind auch eine preisgünstige Methode zum direkten diagnostischen Nachweis bestimmter Genotypen. So können bekannte Deletionen oder Duplikationen eines Gens mittels (Long-Range)-PCR detektiert werden (z.B. CYP2D6-Amplifikation/Deletion, alpha-Globin-Gen-Deletionen etc.) oder das Vorliegen eines Basenaustausch mittels sequenzspezifischer Primer analysiert werden. 

Zu den Hauptvorteilen der PCR zählen ihre Robustheit, Spezifität und Sensitivität. Selbst kleinste DNA-Mengen können damit nachgewiesen und zu diagnostischen Zwecken genutzt werden. Dies birgt jedoch auch die Gefahr der Kontamination. Daher ist es von größter Bedeutung, dass DNA-Proben nicht mit DNA aus anderen Quellen kontaminiert wird. Zur Absicherung werden in jedem Assay auch Kontaminationskontrollen durchgeführt.