Methoden & Technologien

Fragmentlängenanalyse mittels Kapillarelektrophorese
Fragmentlängenanalyse

Diese spezielle Methode kommt zum Einsatz, wenn die Anzahl einer variablen Abfolge von Wiederholungen eines bestimmten Sequenzmotivs, z.B. ‚CCG‘, die mit unterschiedlichen Längen der Allele vorliegen kann (z.B. väterliches Allel: 19 x CCG, mütterliches Allel 20 x CCG, s. Abbildung) ermittelt werden soll.

Abb.: Fragmentlängenanalyse des CGG-Repeats im FMR1-Gen bei einer Patientin mit unauffälligem Genotyp (2 Wildtyp-Allele: z.B: 19xCCG und 20xCCG)

PCR-Produkte aus einem PCR-Ansatz mit einem Fluoreszenz-markierten Primer (z.B. in blauer Farbe) und ein ebenfalls Fluoreszenz-markierter interner Standard (z.B. rote Farbe) werden mit Hilfe der Kapillargelelektrophorese in einer mit einem Polymer gefüllten Kapillare der Größe nach aufgetrennt. Beim Passieren der Detektionseinheit wird die Fluoreszenz der PCR-Produkte und des Standards über einen Laser angeregt und die Fluoreszenzemission detektiert. Der interne Standard dient zur späteren Bestimmung der Fragment-Längen/Größen mit Hilfe einer speziellen Software.

Diese Methode wird bei der molekulargenetischen Analyse von u.a. Triplett-Repeat-Erkrankungen, wie Fragiles X-Syndrom, Spinocerebelläre Ataxien der Typen 1, 2, 3, 6, 7 und 17 angewandt. Hier wird erfasst, ob bei einem Patienten mit entsprechendem klinischen Verdacht eine pathogene Triplett-Repeat –Verlängerung vorliegt.

Es handelt sich um eine etablierte, zuverlässige und robuste Methode in der genetischen Diagnostik, die bereits länger bekannt ist. Je nach Anzahl der Wiederholungen kann die Angabe der Triplett-Zahl nur im Bereich einer Ungenauigkeit erfolgen, die von der zu untersuchenden Sequenz abhängig ist (z.B. bei Normalallelen im ATXN1-Gen von ±1 (29±1CAG)). Zudem ist nur eine eingeschränkte Interpretation bei homozygot erscheinenden Allelen möglich. Hier sollte eine TP (TriplettrepeatPrimed)-PCR angeschlossen werden, mit deren Hilfe bestätigt werden kann, dass kein zweites, stark verlängertes Allel vorliegt, welches in der ‚normalen‘ Reaktion eventuell nicht amplifiziert wurde.