ddPCR (droplet digital PCR)

Bei der digitalen PCR handelt es sich um eine quantitative PCR Methode, mit der eine absolute Quantifizierung von DNA oder RNA möglich ist. Für die Analyse werden die gleichen Reagenzien wie für eine qPCR verwendet, jedoch werden die DNA/cDNA Moleküle vor der Amplifikation in viele tausend Reaktionskammern vereinzelt, mit dem Ziel, nur ein einziges Zielmolekül pro Reaktionskammer zu erhalten. Nach der Amplifikationsreaktion wird das Fluoreszenzsignal aller Reaktionskammern ausgelesen. Dabei wird gemessen und gezählt, ob und in wie vielen Kompartimenten die Zielsequenz amplifiziert wurde.

Die Anzahl der positiven Reaktionen ist direkt proportional zur Gesamtzahl der in der Probe vorhandenen Moleküle. Unter Anwendung der Poisson-Verteilung kann die Konzentration  der Zielsequenz in der Originalprobe bestimmt werden.

Bei der ddPCR wird eine Wasser-Öl Emulsion genutzt, um tausende Tröpfchen (Reaktionsräume) zu erzeugen, in denen die einzelnen PCR Reaktionen stattfinden können.

Es kann im Vergleich zur qPCR eine höhere Spezifität und Sensitivität erreicht werden, da PCR-Inhibitoren wie auch die Competition von Hintergrund-DNA und Zielmolekülen kaum eine Rolle spielen.

Digitale PCR ermöglicht:

• Detektion von seltenen Varianten
• Detektion und Quantifizierung von Pathogenen
• Detektion von genetisch manipulierten Organismen
• Quantifizierung von NGS Libraries und Validierung von Sequenzierergebnissen
• Entwicklung von Referenzen für real time PCR-Assays

Vorteile der real time PCR: höherer Durchsatz