2005 brachte Roche 454 Life Sciences mit dem Genome Sequencer GS 20 das erste Next Generation Sequencing (NGS)-Gerät auf den Markt. In den Jahren danach folgten der Genome Analyzer der Firma Solexa (heute Illumina), das SOLiD-System von Applied Biosystems (heute Life Technologies) und das HeliScope-System der Firma Helicos. Die Systeme basieren zwar auf unterschiedlichen technologischen Ansätzen (Abb. 1), bieten jedoch alle massive parallele Sequenzierung mit einer enormen Steigerung von Durchsatz und Datenmenge.

Der Genome Analyzer von Illumina basiert auf "Sequenzierung-durch-Synthese" und der Verwendung von reversiblen Terminator-Nukleotiden, die mit jeweils einem von vier unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind. Nach dem Aufbringen der Ausgangsprobe in Spuren einer Flusszelle (Flow Cell) werden die genomischen DNA-Moleküle in Clustern klonal amplifiziert, um die Signale für die Datenauswertung zu verstärken. In der anschließenden Sequenzierreaktion wird pro Zyklus ein Nukleotid je Molekül eingebaut und das Fluoreszenzsignal aufgenommen. Die Abfolge der Farben wird schließlich für jede Koordinate direkt in genomische Sequenzen übersetzt.

Das SOLiD-System (Life Technologies) und der Genome Sequencer (Roche 454, mittlerweile als Version GS FLX Titanium verfügbar) verwenden beide eine Bead-basierte Emulsions-PCR zur Amplifikation des Ausgangsmaterials. Die eigentliche Sequenzierung basiert dann bei SOLiD auf "Sequenzierung-durch-Ligation", beim GS FLX auf "Pyrosequencing" (Abb. 2). Bei der SOLiD-Technologie werden die DNA-tragenden Beads auf die Oberfläche eines speziellen Glasobjektträgers aufgebracht und unter Verwendung von Primern passende Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelte 8-mer Oligonukleotide an die DNA ligiert. Über zwei dieser 8 Basen in den Fragmenten ist eine Farbe definiert. Da das Protokoll mehrere Zyklen mit verschiedenen Primern vorsieht, die jeweils um eine Base verschoben sind, wird jedes Nukleotid der Ausgangs-DNA zweimal gelesen. Im so genannten Color Code kann damit unter Verwendung von vier Farben und 16 möglichen Kombinationen eindeutig die genomische Sequenz bestimmt werden.

Für die Pyrosequenzierreaktion auf dem GS FLX werden die DNA-tragenden Beads zusammen mit den Enzymen und Substrat (Luciferin) in Vertiefungen auf so genannten Pico Titre Plates (PTP) aufgebracht. Danach werden die Nukleotide je Zyklus einzeln in einer definierten Reihenfolge zugegeben. Wird ein Nukleotid eingebaut, so generiert die Luciferase durch den Umsatz einer definierten Menge an Luciferin ein Lichtsignal. Werden mehrere gleiche Nukleotide hintereinander eingebaut, so entsteht ein Signal, das proportional zur Menge der Nukleotide ist.

In den letzten fünf Jahren hat sich NGS zu einer wertvollen Methode für verschiedene Forschungsanwendungen in den Bereichen Genomik, Transkriptomik und Epigenomik entwickelt. Viele Projekte wie beispielsweise die Sequenzierung neuer Genome sowie genomweite Resequenzierungs- oder Methylierungs-Analysen können mittlerweile mit deutlich weniger personellem, zeitlichem und finanziellem Aufwand durchgeführt werden. Dennoch scheint das Einsparpotential durch NGS noch nicht ausgereizt zu sein. Verschiedene Firmen arbeiten intensiv an der Entwicklung von Protokollen und Sequenziergeräten der so genannten „Dritten Generation“. Durch den Verzicht auf die aufwändige Präamplifikation des Ausgangsmaterials vor der eigentlichen Sequenzierung oder den Ersatz der Markierungschemikalien (hier v.a. Fluoreszenzfarbstoffe) soll bereits in naher Zukunft die Sequenzierung eines menschlichen Genoms für unter 1.000 USD möglich sein. Doch noch weiß niemand, wie schnell dieses Ziel erreicht werden kann. Bisher hat nur die Firma Pacific Biosciences zu Beginn des Jahres 2010 ein Gerät auf den Markt gebracht. Das Protokoll basiert auf der Änderung von Fluoresenzimpulsen die entstehen, wenn an die Oberfläche gebundene Polymerase-Moleküle markierte Nukleotide in „Echtzeit“ einbauen (Abb. 3). Weitere Mitbewerber wie Oxford Nanopore Technologies oder Ion Torrent (Life Technologies) haben vielversprechende Daten präsentiert, aber bis zur Markteinführung routinetauglicher Protokolle wird noch etwas Zeit vergehen.

Da der von den Sequenziergeräten generierte Datendurchsatz enorm und in den meisten Projekten nicht der limitierende Faktor ist, werden genomische DNA-Proben meist ohne weitere Vorbehandlung direkt für die Sequenzierung vorbereitet. In Anwendungen wie der gerichteten Resequenzierung wird jedoch keine Sequenzierung von Gesamtgenomen benötigt. Deshalb wurde vor über zwei Jahren eine Technologie namens Zielregion-Anreicherung (Target Enrichment) entwickelt. Verschiedene PCR- oder Hybridisierungs-basierte Ansätze wurden danach entwickelt und optimiert (Abb. 4). Die Kombination dieser Methode mit NGS kann die Analyse von krankheitsrelevanten Gen-Sets in der molekulargenetischen Diagnostik durch Verringerung von Zeit und Kosten verbessern. Unter Ausnutzung des enormen Durchsatzes der Geräte können mehrere Gene und Patienten gemeinsam in einem Lauf analysiert werden.

Der Einsatz von NGS in der molekulargenetischen Diagnostik scheint vielversprechend. Fortschritte und Verbesserungen in den Protokollen sowie in den Sequenzier- und Anreicherungs-Technologien werden es in Zukunft erleichtern, klinische Fragestellungen wie mentale Retardierung, hereditäre Herzmuskel- oder Bindegewebserkrankungen, molekular-pathologisches Grading, Infektionserregerspektrum oder HLA-Kompatibilität von Transplantaten schneller und umfangreicher zu bearbeiten. Es ist denkbar, dass die bisher durchgeführte Stufendiagnostik zusammengefasst und in einem Ansatz durchgeführt wird. Im Bereich der Immungenetik wäre es möglich, alle kodierenden Regionen des HLA-Locus in einem Ansatz zu sequenzieren und somit eine bessere Auflösung mit Haplotypinformation zu erhalten. Die Analyse des kompletten MHC-Locus würde darüber hinaus auch Informationen über immunmodifizierende Moleküle zu liefern. Der Nachweis von Minoritäten ist insbesondere in der Leukämie-Diagnostik, aber auch bei soliden Tumoren oder komplizierten Erregerspektren wichtig. Die möglichen Anwendungen gehen noch weit über die erwähnten Beispiele hinaus.