Ein weiteres Verfahren zum Nachweis bekannter Basenaustausche oder Mutationen, welches in der Routinediagnostik zum Einsatz kommt, ist die allelspezifische Hybridisierung von fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden (allelspezifische Oligonukleotid-hybridisierung oder ASO). Bei dieser Technik wird der PCR eine Wildtyp- und eine mutationsspezifische Sonde zugesetzt, deren Fluoreszenz erst sichtbar wird, nachdem die zuvor spezifisch gebundene Sonde durch die DNA-Polymerase im Zuge der Strangelongation abgebaut wurde (sog. Exonuklease-Assay). Je nachdem, ob der Wildtyp oder die Variante/Mutation vorliegt, erhält man unterschiedliche Farbsignale, welche nach Anregung durch Laserlicht in einer Photozelle detektiert werden. Der Vorteil dieses Verfahrens liegt in der Teilautomatisierbarkeit, wodurch größere Probenzahlen schneller bearbeitet werden können.

Eine weitere Methode zur Analyse bekannter Polymorphismen oder Mutationen ist der Nachweis über sequenzspezifische Sonden mittels LightCycler. Dabei wird zu einem DNA-Template ein spezieller Reaktionsmix gegeben, der u.a. Primer und spezifische Sonden enthält. Für die Detektion einer Variante wird jeweils ein Sondenpaar benötigt, das aus einer Anker und einer Sensorsonde besteht. Beide Sonden binden in unmittelbarer Nachbarschaft zueinander an die zu analysierende Sequenz. Nach Exzitation des Fluoresceinmoleküls an der Ankersonde kommt es zum Energietransfer auf das LC-Red-Molekül an der Sensorsonde (Fluoreszenz-Resonanz-Transfer, FRET-Assay). Das von der Sensorsonde emittierte Licht wird gemessen und steht dafür, dass die Sonden korrekt an die Zielsequenz gebunden sind. Die Ermittlung des Genotyps erfolgt über eine Schmelzkurvenanalyse: solange beide Sonden an die Komplementärsequenz gebunden sind, wird Fluoreszenz emittiert. Bei Temperaturerhöhung schmelzen die Sonden ab, der Energietransfer wird unterbrochen und die Fluoreszenzemission nimmt ab. Dieser Verlust des Lichtsignals bei einer spezifischen, empirisch ermittelten Temperatur wird zur Ermittlung des Genotyps herangezogen. Da bei Fehlpaarung einer Base die Sonde früher abschmilzt als bei vollständig homologer Basenpaarung, weichen die Schmelztemperaturen zwischen den verschiedenen Genotypen voneinander ab.