Doppelsträngige Ziel-DNA

Es gibt verschiedene Möglichkeiten, amplifizierte DNA weiter zu untersuchen. Das technisch einfachste Verfahren ist der Nachweis eines veränderten Schnittmusters der DNA nach Verdau mit einem Restriktionsenzym (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus oder RFLP). Restriktionsenzyme sind in der Lage, hochspezifisch die Abfolge bestimmter Basensequenzen zu erkennen und den DNADoppelstrang an dieser Stelle zu durchtrennen. Durch Basenaustausche kann es folglich zum Hinzugewinn oder Verlust einer Restriktionsschnittstelle kommen, wodurch sich nach Restriktionsverdau die Länge der DNA-Fragmente vom Wildtyp (Normalsequenz) unterscheidet. Diese Fragmente lassen sich nach Größenauftrennung im Agarosegel durch Anfärbung mit einem Fluoreszenzfarbstoff darstellen. Das RFLP-Verfahren wird zur Detektion bekannter Basenaustausche sowie zur Bestätigung von neu identifizierten Mutationen eingesetzt.

Ein weiteres Verfahren zum Nachweis bekannter Basenaustausche oder Mutationen, welches in der Routinediagnostik zum Einsatz kommt, ist die allelspezifische Hybridisierung von fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden (allelspezifische Oligonukleotidhybridisierung oder ASO). Bei dieser Technik wird der PCR eine Wildtyp- und eine mutationsspezifische Sonde zugesetzt, deren Fluoreszenz erst sichtbar wird, nachdem die zuvor spezifisch gebundene Sonde durch die DNA-Polymerase im Zuge der Strangelongation abgebaut wurde (sog. ExonukleaseAssay). Je nachdem, ob der Wildtyp oder die Variante/Mutation vorliegt, erhält man unterschiedliche Farbsignale, welche nach Anregung durch Laserlicht in einer Photozelle detektiert werden. Der Vorteil dieses Verfahrens liegt in der Teilautomatisierbarkeit, wodurch größere Probenzahlen schneller bearbeitet werden können.

Eine weitere Methode zur Analyse bekannter Polymorphismen oder Mutationen ist der Nachweis über sequenzspezifische Sonden mittels LightCycler. Dabei wird zu einem DNA-Template ein spezieller Reaktionsmix gegeben, der u.a. Primer und spezifische Sonden enthält. Für die Detektion einer Variante wird jeweils ein Sondenpaar benötigt, das aus einer Ankerund einer Sensorsonde besteht. Beide Sonden binden in unmittelbarer Nachbarschaft zueinander an die zu analysierende Sequenz. Nach Exzitation des Fluoresceinmoleküls an der Ankersonde kommt es zum Energietransfer auf das LC-Red-Molekül an der Sensorsonde (Fluoreszenz-Resonanz-Transfer, FRET-Assay). Das von der Sensorsonde emittierte Licht wird gemessen und steht dafür, dass die Sonden korrekt an die Zielsequenz gebunden sind. Die Ermittlung des Genotyps erfolgt über eine Schmelzkurvenanalyse: Solange beide Sonden an die Komplementärsequenz gebunden sind, wird Fluoreszenz emittiert. Bei Temperaturerhöhung schmelzen die Sonden ab, der Energietransfer wird unterbrochen und die Fluoreszenzemission nimmt ab. Dieser Verlust des Lichtsignals bei einer spezifischen, empirisch ermittelten Temperatur wird zur Ermittlung des Genotyps herangezogen. Da bei Fehlpaarung einer Base die Sonde früher abschmilzt als bei vollständig homologer Basenpaarung, weichen die Schmelztemperaturen zwischen den verschiedenen Genotypen voneinander ab.

Für die Quantifizierung von Genabschnitten oder Transkripten finden die beiden Real-Time-PCR-Plattformen AB7900HT (Applied Biosystems) und LightCycler (Roche) Anwendung. In diesen Geräten findet die Detektion von PCR-Produkten über Fluoreszenzsignale statt, entweder sequenzunspezifisch (z.B. über SYBR Green) oder sequenzspezifisch mittels Fluoreszenzmarkierter Sonden. Die Anregung erfolgt über einen ArgonIonenLaser (AB7900HT) bzw. über eine LED-Lampe (LightCycler). Bei der sequenzspezifischen Detektion werden Sonden eingesetzt, die zu einem Abschnitt der zu analysierenden DNA bzw. cDNA komplementär sind. Die Zunahme des Fluoreszenzsignals im Verlauf der Reaktion ist proportional zur Menge des entstehenden PCR-Produkts und kann im Verlauf der Reaktion online verfolgt werden.

Eine ganze Gruppe genetischer Erkrankungen wird durch eine veränderte DNA-Methylierung von Cytosinresten verursacht (sog. Imprinting-Defekte). Zu dieser Gruppe gehören u. a. das Prader-Willi-Syndrom (PWS) und das Angelman-Syndrom (AS), die beide im Bereich 15q11.2 kartieren. Das PWS beruht auf einer Deletion bzw. einem Methylierungsdefekt des paternalen Allels, wohingegen beim AS das maternale Allel betroffen ist. Die lange Zeit übliche Methode zum Krankheitsnachweis bestand in dem Einsatz Locus-spezifischer FISH-Sonden; diese Methode detektiert jedoch nur ca. 70% der PWS- bzw. AS-Fälle. Mitte der 1990er Jahre wurde die Methylierungsspezifische PCR (MS-PCR) entwickelt, die eine Detektionsrate von 99% (WS) bzw. 80% (AS) aufweist. Das Verfahren beruht auf der Umwandlung unmethylierter Cytosinreste zu Uracil mittels Natriumbisulfit und dem Einsatz von Primerpaaren, die entweder die nicht-modifizierte maternale oder die modifizierte paternale DNA erkennen.

Ein in Schweden entwickeltes Verfahren zum Nachweis bekannter Mutationen oder SNPs ist das Pyrosequencing. Ähnlich der klassischen DNA-Sequenzanalyse mit dem Sanger-Verfahren (s.u.) kann mittels Pyrosequencing die DNA-Sequenz direkt analysiert werden. Allerdings beruht die Reaktion nicht auf der Detektion von Fluoreszenzsignalen von eingebauten Stop-Nukleotiden, sondern auf einer messbaren Lichtemission, wenn das jeweils passende Nukleotid bei der Strangelongation in die DNA eingebaut wird. Nach Amplifikation des zu untersuchenden Genabschnitts mittels PCR werden in der Sequenzierungsreaktion die Nukleotide daher einzeln und nacheinander in immer wiederkehrender Abfolge der Reaktion zugegeben. Das jeweils passende Nukleotid, welches bei der Strangelongation in die DNA eingebaut wird, führt zur Freisetzung von Pyrophosphat (PPi), wodurch unter Beteiligung von Luciferase ein Lichtsignal freigesetzt wird. Das Lichtsignal wird von einer CCD-Kamera detektiert und als Peak in der Auswerte-Software sichtbar. Dabei ist die Peak-Höhe proportional zur Anzahl der eingebauten Nukleotide. Nach Ablauf jeder Einzelreaktion werden nicht eingebaute Nukleotide degradiert, wodurch das Lichtsignal erlischt und der Reaktionsablauf mit der Zugabe des nächsten Nukleotids von neuem beginnt. Mit Ablauf dieses Prozesses kann die Sequenz anhand der Signal-Peaks im Pyrogramm bestimmt werden. Das Verfahren eignet sich besonders zur Analyse kurzer bis mittellanger DNA-Sequenzen, die im Hochdurchsatzbetrieb bestimmt werden sollen. Besonders im Bereich der Polymorphismusanalyse kann so ein hohes Probenaufkommen in relativ kurzer Zeit bewältigt werden.

Die Suche und der Nachweis unbekannter Mutationen erfordert aufwändigere Verfahren. Der Goldstandard ist die direkte DNA-Sequenzanalyse der einzelnen kodierenden Abschnitte (Exons) eines definierten Gens sowie deren angrenzende Regionen nach Amplifikation durch PCR. In der Sequenzierungsreaktion werden neben der DNA-Polymerase und dem Nukleotid-Mix zusätzlich fluoreszenzmarkierte Stopnukleotide (Dideoxy-Nukleotide) eingesetzt, beideren Einbau es zu einem Abbruch der Reaktion an dieser Stelle kommt. Hierdurch entstehen fluoreszenzmarkierte Sequenzfragmente unterschiedlicher Länge, die sich auf einem Polyacrylamidgel der Größe nach auftrennen und mittels Laserlichtanregung darstellen lassen. Für die Entwicklung dieses Verfahrens wurde Fred Sanger mit seinem 2. Nobelpreis ausgezeichnet.

Die Methode zur Detektion von Dosisunterschieden von bis zu 45 verschiedenen Nukleinsäurefragmenten in einem Ansatz wurde 2002 erstmals beschrieben (Schouten et al., Nucl Acids Res 30:12e57). Hier wurde die Kopienzahl von 40 Loci im menschlichen Genom durch simultane relative Quantifizierung bestimmt. Die Menge der sequenzspezifisch hybridisierten und ligierten Oligonukleotide ist dabei proportional zur Kopienzahl der Ziel-Sequenz. Die Amplifikationsprodukte werden anschließend durch Kapillarelektrophorese der Größe nach aufgetrennt. Dosisunterschiede sind durch Reduktion oder Vergrößerung der Peakhöhen und Peakflächen erkennbar. Mittlerweile sind mehr als 100 MLPA-Kits zur Detektion von Deletionen/Duplikationen einzelner Exons von Genen, Genbereichen, ganzer Gene, Chromosomenbereiche und ganzer Chromosomen kommerziell verfügbar (MRC-Holland b.v.).

Der Oligonukleotid-LigationAssay wird in der Routine vorwiegend für die Analyse eines Mutationspanels in der Mukoviszidose-Diagnostik eingesetzt. In einer Multiplex-PCR werden 16 Zielregionen des CFTR-Gens amplifiziert. Die PCR-Produkte aus der Multiplex-PCR dienen als Ausgangsmoleküle für eine Ligationsreaktion, die durch Zugabe eines OLA-Reagenz gestartet wird. Das OLA-Reagenz enthält Oligonukleotide, welche teilweise fluoreszenzmarkiert sind sowie eine DNA-Ligase. Bei der Reaktion werden 3 Sondentypen eingesetzt: a) eine gemeinsame (“common”) Sonde, die am 3`-Ende mit einem Fluoreszenzfarbstoff (blau, grün oder gelb) markiert ist, b) 29 wildtypspezifische Sonden und c) 33 mutationsspezifische Sonden. Die gemeinsame Sonde bindet an die Zielsequenz unabhängig davon, ob eine Wildtyp oder mutante Sequenz vorliegt. Die Wildtyp- und Mutationssonden unterscheiden sich nur durch ein Nukleotid am 3`-Ende. Am 5`-Ende von Wildtyp- und Mutationssonde hängt jeweils ein sog. PEO-Molekül, dessen Länge spezifisch für jede nachzuweisende Zielsequenz ist. Die Wildtyp- und Mutationssonden konkurrieren um die Bindungsstelle an die Zielsequenz, wobei nur die Sonde bindet, die exakt mit der Zielsequenz komplementär ist. Liegt keine der 33 zu analysierenden Mutationen vor, binden nur die Wildtypsonden. Ist eine Mutation homozygot vorhanden, bindet nur die Mutationssonde. Bei Heterozygotie binden sowohl Wildtypals auch Mutationsonde an die Zielsequenz. Die DNA-Ligase verknüpft die gemeinsame und Wildtyp- oder Mutationssonde nach Hybridisierung an die Zielsequenz. Jedes Ligationsprodukt kann nun über seine spezifische Länge und die unterschiedliche Fluoreszenzmarkierung der gemeinsamen Sonde kapillarelektrophoretisch nachgewiesen werden.

Zur Charakterisierung der für eine Erkrankung zuständigen chromosomalen Regionen werden zwei in der Genetik beobachtete Phänomene verwendet: Assoziation und genetische Kopplung. Beide Ansätze beziehen sich auf die Abweichung vom dritten Mendelschen Gesetz, welches besagt, dass Merkmale unabhängig voneinander vererbt werden. Eine Assoziation liegt vor, wenn ein spezifisches Allel (Marker) in der Population häufiger bei erkrankten als bei gesunden Personen vorkommt. Bei der Berechnung dieser “Wette” (Odds) wird die Wahrscheinlichkeit, dass Ereignis A eintritt dividiert durch die Wahrscheinlichkeit, dass es nicht eintritt:

Die Ausprägung einer Assoziation kann durch die Odds Ratio (OR) beschrieben werden. Diese kann als Kreuzprodukt

aus der folgenden 4-Felder-Tafel ermittelt werden:

Eine positive Assoziation liegt vor, wenn OR > 1 ist, eine negative Assoziation liegt vor, wenn OR < 1 ist. Je schwächer der Marker für eine bestimmte Erkrankung ist, desto mehr nähert sich die OR dem Wert 1 (neutraler Marker, keine Assoziation). Das Erkrankungsrisiko für ein Individuum wird durch das relative Risiko (RR) abgeschätzt:

Man spricht von Kopplung, wenn eine Krankheit zusammen mit einem genetischen Marker überzufällig häufig vererbt wird. Dabei ist ein genetischer Marker definiert als eine polymorphe DNA Sequenz, die in mindestens zwei Varianten vorkommt und deren Varianten nicht seltene Allele sind. Als Marker kommen zur Anwendung:

• Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs)
• Mikrosatelliten
• Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen (RFLP)

Die meisten in der Forschung eingesetzten Marker sind neutrale genetische Varianten und stehen in keinem ursächlichen Zusammenhang mit einer Krankheit, da sie sowohl bei Gesunden als auch bei Erkrankten auftreten. Voraussetzung für eine Kopplungsanalyse (in der Genetik auch als “indirekte Diagnostik” bezeichnet) ist, dass der Marker Locus mit der zu analysierenden Mutation gekoppelt, d.h. auf einem Chromosom bzw. Allel lokalisiert ist.

Anschließend wird der Quotient Z(ϑ)= L(ϑ)/ L(0,5) gebildet, der die Rekombinationswahrscheinlichkeit L(ϑ) der Wahrscheinlichkeit freier Rekombination gegenüberstellt. Der Sinn dieses Quotienten besteht darin, die Güte der Schätzung L(ϑ) zu beschreiben: je größer der Quotient, desto größer ist die Güte.

Um das Rechnen mit dem Quotienten zu erleichtern, wird der Logarithmus mit der Basis 10 gebildet, der als Lod (logarithm of the Odds) Score bezeichnet wird und ein Maß für das Vorliegen von Kopplung darstellt. Ein Lod Score > 3 wird allgemein als ein Wert betrachtet, bei dem eine Kopplung anzunehmen ist, da hier die Kopplungswahrscheinlichkeit 1:1.000 beträgt und damit freie Rekombination fast ausgeschlossen werden kann. Bei einem Lod Score < 2 kann eine Kopplung hingegen ausgeschlossen werden. Das Argument ϑ beim Maximum des LodScores ist die maximal wahrscheinliche Rekombinationsfraktion.

Risikoberechnung bei der indirekten Gendiagnostik

Der Anteil der Gene und Mutationen, die zu erblichen, monogenen Erkrankungen beim Menschen führen und die einer direkten Genanalyse zugänglich sind, wächst derzeit rasch an. Eine direkte Genanalyse ist allerdings erschwert, wenn intragenische Heterogenie vorliegt,

d.h. wenn verschiedene Mutationen an einem Genort vorliegen, die außerhalb der routinemäßig analysierten Anteile (kodierende Sequenzen und Spleissstellen) zu derselben Krankheit führen können. In einigen dieser Fälle besteht die Möglichkeit einer indirekten DNADiagnostik, die mittels Kopplungsanalyse durchgeführt wird. Durch die Kopplungsanalyse ist es möglich, die Vererbung des polymorphen Markers in einer Familie zu verfolgen und dies mit dem Auftreten der Erkrankung zu korrelieren.

In dieser Vorgehensweise liegt jedoch zugleich eine Problematik der indirekten Analyse. Das Ergebnis einer indirekten GenAnalyse ist die Angabe einer Wahrscheinlichkeit des Erkrankungsrisikos anstatt eines Nachweises der krankheitsauslösenden Mutation. Zur Berechnung des Erkrankungsrisikos kann das Theorem von Bayes eingesetzt werden. Dieses Theorem erlaubt das Kombinieren von Einzelwahrscheinlichkeiten zu einer Gesamtwahrscheinlichkeit. Die Wahrscheinlichkeiten können durch die Analyse der Familienstammbäume ermittelt werden. Laut dem Bayes´schem Theorem wird die Wahrscheinlichkeit einer Hypothese aus den Wahrscheinlichkeiten einzelner Beobachtungen wie folgt bestimmt: