Dr. rer. nat. Christoph Marschall, Dr. rer. nat. Karin Mayer

Die molekulare Genetik in der Medizin ist die Wissenschaft krankheitsrelevanter biologischer Variation des Erbgutes. Die klinische Genetik hat die genetische Beratung, die klinische Diagnostik, die Krankheitsprävention und schließlich die Therapie genetisch bedingter bzw. familiärer Erkrankungen zum Ziel. Die Genetik als naturwissenschaftliche Fachdisziplin ist nicht so neu, wie es beim Studium medizinischer Fachliteratur erscheinen mag. Gregor Mendel, der bereits vor mehr als 100 Jahren auch heute noch gültige Gesetzmäßigkeiten der Vererbung anhand von Kreuzungsexperimenten mit Erbsen formulierte (die Mendelschen Regeln), ist uns allen ein Begriff. Viele von uns erinnern sich aus dem Biologieunterricht an Thomas Morgan, der Anfang des 20. Jahrhunderts die Vererbung von Merkmalen an der Fruchtfliege (Drosophila) studierte und zeigen konnte, dass bestimmte Merkmale geschlechtsspezifisch vererbt werden und zufällige Rekombinationen während der Meiose (Crossing Over) für Änderungen des Phänotyps verantwortlich sind. Alfred Sturtevant, einer von Morgans Doktoranden, führte die ersten Kopplungsexperimente durch und konstruierte bereits in den 20er Jahren anhand von phänotypischen Merkmalen tausender von Fruchtfliegen die erste „GenKarte“. Die korrekte Nummerierung der menschlichen Chromosomen 1956 durch Joe Hin Tjio war die Voraussetzung zur Bestimmung von Chromosomenaberrationen, die 1959 mit dem Down Syndrom begann. Die Beschreibung der DNA-Struktur als Doppelhelix durch Watson & Crick liegt heute bereits 50 Jahre zurück. Die funktionelle Organisation der DNA und RNA in Codons wurde in den 60er Jahren entdeckt, und Victor McKusick, einer der Väter der klinischen Genetik, publizierte bereits vor über 30 Jahren einen Katalog von menschlichen Erbkrankheiten unter dem Titel Mendelian Inheritance in Man http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM). Warum nimmt gerade in heutiger Zeit die Genetik, Gendiagnostik, Gentherapie oder Gentechnik einen immer größeren Stellenwert ein? Welche Vorteile bringen die Erkenntnisse der molekularen Genetik für die einzelne Patientin, den einzelnen Patienten?

Die Antworten auf diese Fragen sind vielschichtig. Voraussetzung für die explosionsartige Wissenszunahme in der Molekulargenetik in den letzten 15 Jahren waren mehrere bahnbrechende Entdeckungen in den vorausgegangenen 20 Jahren. Restriktionsenzyme, die DNA an spezifischen Sequenzen schneiden, wurden von Werner Arber und Hamilton Smith 1970 gefunden und waren das Handwerkszeug für die Restriktionskartierung des menschlichen Genoms mittels “Southern Blot” (Edwin Southern 1975). Die rekombinante DNA-Technologie ermöglichte Anfang der 70er Jahre unter großen Vorbehalten der Öffentlichkeit erstmals, Fremd-DNA in Bakterien einzuschleusen und dort zu vermehren (Klonierung). Weitere Entdeckungen, welche die technischen Voraussetzungen für eine breite Anwendung molekularbiologischer Methoden schufen, folgten bald Schlag auf Schlag. Zu den ersten, Ende der 70er Jahre klonierten Genen gehörten die Gene für die Hämoglobin α und ß-Ketten. Zu dieser Zeit war es möglich, die Sequenzabfolge der DNA mit einem einfachen enzymatischen Verfahren zu bestimmen. Fred Sanger erhielt hierfür nach Entwicklung der Proteinsequenzierung seinen zweiten Nobelpreis. Der Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen machte 10 Jahre später die Entwicklung von Sequenziergeräten mit automatischem “Readout“ und einer Vervielfachung des Probendurchlaufs möglich. Kurz darauf wurde an den National Institutes of Health (NIH) in Bethesda (USA) das Humane Genomprojekt (HGP) ins Leben gerufen, mit der Zielsetzung, bis zum Jahre 2005 das gesamte menschliche Genom zu entschlüsseln. Begonnen wurde das Humangenomprojekt 1990.

An der Entschlüsselung der 3 Milliarden Basenpaaren, aus denen das menschliche Genom besteht, arbeiteten einerseits öffentliche Institutionen in aller Welt (vor allem in den USA, Japan und England) unter Führung des NIH. Die wissenschaftlichen Gründungsväter des Projekts schlossen sich unter dem Namen “Human Genome Organization” (HUGO) zusammen. Andererseits begannen auch private Firmen vor allem in den USA wie z.B. TIGR (The Institute of Genome Research) oder HGS (Human Genome Sciences), die zum Teil in der Gründung des derzeit führenden Unternehmens Celera aufgingen, mit der systematischen Analyse des menschlichen Genoms, um die genetische Information kommerziell nutzen zu können. Als sich im Februar 2001 die Forscher des öffentlichen Humangenomprojekts und ihr kommerzieller Konkurrent Craig Venter (Celera) zeitgleich in Amerika, China, Japan und Deutschland der Presse stellten, setzten sie mit der Veröffentlichung des ersten Entwurfs der Sequenz des menschlichen Genoms einen Meilenstein der biomedizinischen Forschung. Zeitgleich erfolgte auch die Publikation der Daten in den beiden führenden wissenschaftlichen Journalen ”Nature” (öffentliches Konsortium) und ”Science” (Celera). Die ersten Versionen der Sequenz verursachten Kosten von ungefähr 3 Milliarden US-Dollar und enthielten zudem noch ca. 150.000 Lücken. Diese Lücken konnten inzwischen gefüllt werden, sodass im Juni 2006 eine vervollständigte Kartierung aller Chromosomen in Nature publiziert wurde.

Das eigentlich Überraschende ist, dass nur ca. 1% der DNA für Proteine kodieren und die Zahl der menschlichen Gene mit ca. 31.000, von denen bislang ca. 26.000 aufgelistet werden können, viel geringer ist, als ursprünglich angenommen. Im Vergleich hierzu hat die Fruchtfliege 13.000 Gene, Würmer ca. 18.000 und Pflanzen ca. 26.000. Mit weniger Genen wird es jedoch nicht unbedingt einfacher, die Vorgänge in der Zelle zu verstehen. Die mögliche Funktion zahlreicher neu identifizierter Gene lässt sich anhand spezifischer Domänen mit Computerprogrammen vorhersagen und in allgemeine Funktionsklassen einordnen, wobei für 41% keine Funktion zugeordnet werden konnte. Das durchschnittliche Gen erstreckt sich über eine Länge von 30.000 Basenpaaren, wobei nur 5% dieser Sequenzinformation Proteinkodierend ist. Ungefähr die Hälfte des gesamten Genoms besteht aus Wiederholungen kurzer Sequenzen großteils unbekannter Funktion. Die meisten unserer Gene sind sehr alten Ursprungs, weniger als 10% der Genfamilien sind spezifisch für Vertebraten, zu denen insbesondere Gene der erworbenen Immunantwort, der Signaltransduktion, der neuronalen Komplexität, der Blutgerinnung und für den programmierten Zelltod gehören. Der größte Unterschied zwischen Mensch und Würmern oder Fruchtfliegen liegt in der Komplexität der menschlichen Proteine, die besonders viele Domänen oder neue Kombinationen von Domänen aufweisen. Einige unserer Gene scheinen von Bakterien zu stammen. Jedoch nicht im Zuge der Evolution, sondern direkt durch Bakterien übertragen.

Um die Erkenntnisse bezüglich der DNA-Sequenz des humanen Genoms verwerten zu können, ist es nun erforderlich, die Funktion einzelner Gene und Erbgutabschnitte zu bestimmen (Functional Genomics). Der Ansatz der reversen Genetik, bei der der Einfluss bestimmter Gene auf den Phänotyp untersucht wird, hat seit den 90er Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Hierbei werden mutante Tiere, sogenannte “knockout” oder “transgene” Tiere hergestellt, deren Gene in den Keimbahnzellen verändert und die physiologischen Konsequenzen in den Nachkommen untersucht werden können. Nach Identifikation der betroffenen Gene kann aufgrund der starken Homologie zu den entsprechenden menschlichen Genen auf deren Funktion geschlossen werden. Verschiedene Mutagenese-Projekte haben interessante Tiermodelle für humane Erkrankungen hervorgebracht.

Bei der systematischen Genomforschung zeigte sich, dass die DNA-Sequenz des Genoms einer Spezies zahlreiche Varianten aufweist. Ein Vergleich der Erbinformation verschiedener Menschen, aber auch bereits des maternalen und paternal ererbten Genoms eines Menschen, zeigt punktuelle Abweichungen der DNASequenz. Durchschnittlich findet man eine Abweichung, die als Single Nucleotide Polymorphism (SNP) bezeichnet wird, pro 1.000 Basenpaare. Inzwischen geht man genomweit von ca. 10 Millionen SNPs aus, etwa 93% der Gene tragen zumindest einen SNP. SNPs entstehen zufällig z.B. durch Fehler bei der Vervielfältigung der DNA. In evolutionsbiologischen Projekten wird versucht, die Entwicklung des Homo Sapiens im Laufe der letzten 150.000 Jahre und dessen Verbreitung von Afrika ausgehend, anhand der Verteilung dieser SNPs in den verschiedenen Populationen nachzuvollziehen. Die SNPs unterliegen, sofern sie einen Einfluss auf die individuelle Fitness und Reproduktionsrate haben, den Mechanismen der Selektion. SNPs, die mit Erkrankungen assoziiert sind, können in einer Population nur dann dauerhaft bestehen, wenn sie für die Reproduktionsphase irrelevant sind, da die Erkrankung erst im höheren Alter auftritt. Dies trifft z.B. für die für die Alzheimer-Erkrankung disponierenden ApoE4-SNPs zu. Für manche SNPs wird ein zusätzlicher protektiver Effekt z.B. bezüglich Infektionskrankheiten postuliert, der zu deren positiver Selektion geführt hat.

Ein wesentliches Merkmal und die klinische Bedeutung der SNPs liegen darin, dass sie häufig nur bei bestimmten Umweltbedingungen oder Lebensgewohnheiten zum Tragen kommen und zu einer Erkankung führen. Man spricht in diesem Zusammenhang dann von einem genetischen Risikofaktor oder Risikoallel. So haben z.B. heterozygote Träger des Faktor V-Leiden-Polymorphismus zwar ein gegenüber der Normalbevölkerung 5-10-fach erhöhtes Thromboserisiko, die meisten Anlageträger bekommen aber dennoch im Laufe des Lebens keine Thrombose. Kommen jedoch zusätzliche exogene Risikofaktoren wie Rauchen oder die Einnahme von Kontrazeptiva hinzu, erhöht sich das Thromboserisiko multiplikativ. So hat eine Frau mit Faktor V-Leiden-Polymorphismus, die zusätzlich Kontrazeptiva einnimmt, bereits ein ca. 30-faches Thromboserisiko. Eine erhebliche genetische Komponente ist heute bei der Entstehung multifaktorieller Erkrankungen unbestritten. Vermutlich ergibt sich das genetische Risiko erst aus dem Zusammenspiel vieler SNPs zahlreicher Gene. Der Effekt eines einzelnen SNP ist in der Regel jedoch so gering, dass eine genetische Diagnostik nicht sinnvoll ist. Die Hauptanwendung der SNPs liegt momentan in der Forschung, wo sie vor allem für Assoziationsstudien genutzt werden.

Inzwischen sind ca. 14.000 Gene mit vermuteten Krankheitsassoziationen und ca. 3.500 Erkrankungen mit klar definierter molekulargenetischer Ursache im OMIM-Katalog von Victor McKusick aufgelistet. Bei diesen Erkrankungen handelt es sich in erster Linie um monogene Erkrankungen, die bis auf Ausnahmen jede für sich seltener als 1 Fall pro 10.000 Personen in der Bevölkerung vorkommen. Insgesamt sind jedoch ungefähr 1% aller Neugeborenen von einer dieser seltenen Erkrankungen betroffen. Die monogenen Erkrankungen unterscheiden sich von den multifaktoriellen Erkrankungen abgesehen von der Frequenz in der Gesamtbevölkerung auch durch die hohe Penetranz der ursächlichen Mutationen. Dies bedeutet, dass Träger einer Mutation auch mit großer Wahrscheinlichkeit im Laufe ihres Lebens erkranken. Bei vielen dieser Erkrankungen ist die Penetranz sogar 100% wie beispielsweise bei der Chorea Huntignton oder bei der Frühform der Alzheimer-Erkrankung. Dies hat erhebliche Konsequenzen für die Untersuchung nicht-symptomatischer Nachkommen von Anlageträgern. Bei derart schwerwiegenden Erkrankungen, zu denen auch die familiären Tumorerkrankungen zählen, ist eine genetische Beratung vor der molekulargenetischen Untersuchung nicht-symptomatischer Verwandter von Anlageträgern unumgänglich. Die molekulargenetische Untersuchung monogener Erkrankungen dient meist der Bestätigung einer Verdachtsdiagnose. Auch bei der zum Teil schwierigen Differentialdiagnostik kann die Molekulargenetik hilfreich sein. So führen beispielsweise unterschiedliche Mutationen im Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor-Gen 3 (FGFR3) zu unterschiedlich schweren Verläufen von dysproportioniertem Kleinwuchs, das Spektrum der Ausprägung reicht von fast unauffällig bis neonatal letal. Bei Kenntnis der Mutation lässt sich hier der zu erwartende Phänotyp relativ exakt prognostizieren. Es wird jedoch auch häufig versucht, bestimmte Erkrankungen molekulargenetisch auszuschließen. Mit letzter Sicherheit ist dies meist nicht zu bewerkstelligen, da die Sensitivität der verwendeten Methoden selten über 95% beträgt und bei vielen Erkrankungen genetische Heterogenität bekannt ist oder zumindest vermutet werden muss.

Dennoch hat sich die molekulargenetische Analyse zur Diagnosesicherung bei vielen Erkrankungen bewährt. Bei Verwandten von Indexpatienten mit nachgewiesener Mutation kann die Diagnose meist sehr zuverlässig und kostengünstig gestellt werden. Insbesondere bei unklarer klinischer Symptomatik oder bereits im Frühstadium ist dies hilfreich. Bei einigen Erkrankungen hat der Nachweis einer Mutation einen wesentlichen Einfluss auf die Therapie und die Prognose des Patienten. So kann zum Beispiel das Risiko bei familiären Tumorerkrankungen von Art und Lokalisation der Mutation abhängig sein (BRCA-Mutationen beim familiären Brustkrebs). Auch beim lebensbedrohlichen Long-QT-Syndrom ist es bedeutsam, ob ein Kalium oder ein Natrium-Kanal betroffen ist. In den meisten Familien mit seltenen genetischen Erkrankungen werden bisher nicht bekannte Mutationen nachgewiesen, die zum Teil schwierig zu bewerten sind. Je länger diese Diagnostik jedoch angewandt wird, desto häufiger stößt man auf Mutationen, die bereits aus anderen Familien bekannt sind. Hieraus erhält man zusätzliche Informationen zur Bewertung des Schweregrads und Prognose des Krankheitsverlaufs. Mit zunehmender Erfahrung erleichtert sich auch die Aufgabe, kausative Mutationen von Polymorphismen und Varianten mit geringem Krankheitswert zu unterscheiden. Zusätzlich steigt der Anteil an Familien, in denen Mutationen bereits bekannt sind, sodass der Aufwand der Diagnostik durch die Möglichkeit der gezielten Mutationssuche in den meisten Fällen sehr gering ist. Daher ist die Fachwelt überzeugt, dass die molekulargenetische Diagnostik künftig weiter an Bedeutung gewinnen wird. Dies wird auch durch den Umstand begünstigt, dass die Technologie der Mutationssuche in den letzten Jahren rasant weiterentwickelt hat.

Seit den 70er Jahren ist die Sanger-Sequenzierung der Gold-Standard zur Detektion von Mutationen in der Diagnostik. Trotz der hohen Datenqualität und der teilweisen Automatisierung ist die Methode teuer und relativ zeitaufwändig. Derzeit wird die Sanger-Sequenzierung daher zunehmend durch moderne Next Generation Sequencing (NGS)-Verfahren ersetzt (siehe auch Analysetechniken). Diese Technologien haben gemeinsam, dass die Sequenzierung hoch parallelisiert und miniaturisiert durchgeführt wird. Die Analyse von einigen Genen oder ganzen Exomen, die die gesamte proteinkodierende Sequenz aller Gene enthält, wird hierdurch ermöglicht. Da für viele monogene Erkrankungen inzwischen zahlreiche Gene bekannt sind, die alternativ ursächlich sein können, ist es wesentlich schneller und günstiger, simultan alle in Betracht kommenden Gene mittels NGS zu analysieren statt wie bisher Gen für Gen mittels Sanger-Sequenzierung. Beispielsweise sind bei der dilatativen Kardiomyopathie (DCM) über 40 ursächliche Gene bekannt. Das größte menschliche Gen Titin, das alleine über 100.000 Basenpaare kodierende Sequenz enthält, gehört ebenfalls dazu. Eine Analyse von Titin mittels Sanger-Sequenzierung zu diagnostischen Zwecken war daher bislang undenkbar. Inzwischen konnte mittels NGS gezeigt werden, dass Titin in ca. 25% der DCM-Patienten ursächliche Mutationen aufweist. Durch die Einführung von preiswerten Tischgeräten mit mittlerem Durchsatz wurde der Einzug der NGS-Technologie in die Diagnostik erleichtert. In der Regel beschränkt sich die Diagnostik wie im Beispiel der DCM auf die Analyse einiger Gene. Dies ist nicht nur im Hinblick auf das Gendiagnostikgesetz sondern auch aufgrund der Komplexität der Auswertung der anfallenden Daten bei Gesamtgenom- oder Exomsequenzierung sinnvoll. Trotz der wachsenden Kenntnisse auch im Bereich der häufigen multifaktoriellen Erkrankungen ist es derzeit verfrüht, Ergebnisse aus der Genomsequenzierung zur Prädiktion von Erkrankungsrisiken für Diabetes Typ 2, Bluthochdruck, Osteoporose, koronare Herzerkrankung, Schlaganfall und Krebs heranzuziehen. Daher sind kommerzielle Gesamtgenomsequenzierungen im Zusammenhang mit multifaktoriellen Erkrankungen kontraproduktiv. Die Ergebnisse sind kaum zu interpretieren und tragen nur zur Verunsicherung der Patienten und Ärzte bei. Ob es in wenigen Jahren sinnvoll sein wird, eine Genomsequenzierung durchzuführen, um etwas über Erkrankungsrisiken zu erfahren bzw. eine personalisierte Therapie zu unterstützen, kann derzeit nicht beantwortet werden.